Caracterização bioquímica e estrutural da proteína Fator Inibidor da Migração de Macrófagos (MIF) como potencial alvo para fármacos contra Paracoccidioidomicose
Nome: PAULO ARTHUR COUTINHO
Tipo: Dissertação de mestrado acadêmico
Data de publicação: 14/12/2020
Orientador:
Nome |
Papel |
|---|---|
| JULIANA BARBOSA COITINHO GONCALVES | Orientador |
Banca:
| Nome |
Papel |
|---|---|
| JULIANA BARBOSA COITINHO GONCALVES | Orientador |
| LUCAS CUNHA DIAS DE REZENDE | Examinador Interno |
| RENATO GRACIANO DE PAULA | Examinador Externo |
| VIVIANE CRISTINA FERNANDES DOS SANTOS | Coorientador |
Resumo: A Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica endêmica da América Latina, com uma grande incidência no Brasil e com casos relatados no Espírito Santo. Essa doença, causada por fungos do gênero Paracoccidioides, afeta os pulmões e outros órgãos e pode ser fatal se o tratamento correto não for empregado. O tratamento da PCM é realizado com antifúngicos tradicionais, sendo seu custo muito alto e prolongado. A proteína MIF (fator inibidor da migração de macrófagos), que, em helmintos, parece facilitar o estabelecimento da infecção, não apresenta estrutura tridimensional resolvida em Paracoccidioides e sua sequência primária diverge de outras proteínas MIF. Inicialmente, para a escolha da MIF como objeto de estudo, os servidores XtalPred, Expasy e BlastP foram utilizados e demonstraram ser a MIF um bom alvo para caracterização bioquímica-estrutural. Além disso, a estrutura secundária e terciária da MIF foi predita pelos servidores ESPrit, PsiPred e i-TASSER, demonstrando que sua estrutura global predita concorda com MIF de outros organismos, mas apresenta diferenças importantes para a MIF de humanos que podem ser exploradas num contexto de tratamento da PCM. Dessa forma, a região codificadora para MIF foi clonada no vetor pET-28aTEV. O vetor recombinante foi inserido nas cepas de Escherichia coli BL21, ArcticExpress, Rosetta, Lemo21 e C43. Vários testes de expressão variando concentração de indutor, temperatura e tempo de indução e uso de diferentes aditivos foram realizados, além de diferentes protocolos de lise com o intuito de obter a proteína MIF na fração solúvel. Assim, a proteína recombinante foi expressa na fração solúvel somente da cepa de E. coli Rosetta com indução a 18 °C por 72 horas e 1 mmol.L-1 de IPTG com adição de etanol 1% (v.v -1 ) e foi purificada por cromatografia de afinidade ao cobalto. Todos os esforços para purificação da MIF a partir da fração solúvel se justificam por esse passo ser essencial para sua caracterização bioquímica-estrutural, o que certamente contribuirá para o desenvolvimento de fármacos mais efetivos para o tratamento, assim como uma alternativa de diagnóstico mais eficiente.
PALAVRAS-CHAVE: Paracoccidioides, Paracoccidioidomicose, PCM, Fator Inibidor da Migração de Macrófagos, MIF.
