Catecol-O-metiltransferase de Paracoccidioides spp.: avanços na caracterização bioquímica e estrutural
Nome: MARIELLY MOURA MARTINS
Tipo: Dissertação de mestrado acadêmico
Data de publicação: 30/03/2022
Orientador:
Nome |
Papel |
|---|---|
| JULIANA BARBOSA COITINHO GONCALVES | Orientador |
Banca:
| Nome |
Papel |
|---|---|
| DÉBORA MARIA ABRANTES COSTA | Examinador Externo |
| JULIANA BARBOSA COITINHO GONCALVES | Orientador |
| RENATO GRACIANO DE PAULA | Examinador Interno |
Resumo: Fungos do gênero Paracoccidioides são agentes causadores da micose sistêmica Paracoccidioidomicose (PCM), que afeta primariamente os pulmões podendo acometer outros tecidos. A PCM é endêmica da América Latina e o Brasil é o país que responde por 80% dos casos relatados seguido da Colômbia e Venezuela. O tratamento é realizado com antifúngicos e é prolongado, de custo elevado e com efeitos colaterais, o que desencoraja os pacientes a segui-lo, aumentando a reincidência da doença, além dos já relatados casos de resistência. Assim, a busca por novos alvos farmacológicos continua sendo importante. A proteína catecol-O-metiltransferase (COMT) pode ser um possível alvo farmacológico para tratamento da PCM pois em outros fungos ela parece participar da sua sobrevivência no hospedeiro, porém, em Paracoccidioides ela nunca foi estudada e não possui sua estrutura tridimensional resolvida. A COMT possui baixa variabilidade genética entre as espécies de Paracoccidioides e baixa similaridade com a COMT humana. Para isso, bactérias Escherichia coli Rosetta(DE3) e Arctic Express foram transformadas com o vetor de expressão pET28a(TEV) contendo o gene comt foram utilizadas para expressão recombinante desta proteína com o intuito obtê-la em grande quantidade e funcional. Diferentes condições de expressão, lise e purificação por afinidade foram avaliadas. Após avaliação de diferentes protocolos, a COMT apresentou expressão solúvel, ainda que em pouca quantidade, tanto quando expressa em bactéria E. coli Arctic Express quanto em Rosetta. Em E. coli Arctic Express, a expressão foi confirmada por Western blot utilizando anticorpo anti-His. Além disso, amostras obtidas a partir das duas cepas e purificadas por afinidade apresentaram atividade de catecol-O-metiltransferase. Análises in silico foram realizadas e mostraram que a estrutura tridimensional da COMT de Paracoccidioides predita pelo servidor I-TASSER apresenta o enovelamento típico de O-metil-transferases com poucas divergências entre diferentes MTs identificadas no PDB (localizadas especialmente nas regiões de loops). Ademais, por alinhamentos estruturais, resíduos de aminoácidos que interagem com o substrato e com os cofatores da COMT também foram preditos e podem guiar os estudos de docking para o desenho de inibidores para a proteína. Com a caracterização da COMT pretende-se que seja possível entender melhor a biologia dos fungos do gênero Paracoccidioides e criar conhecimentos sólidos que poderão ser utilizados para o desenvolvimento de novos e mais poderosos fármacos contribuindo para diversificar o arsenal antifúngico disponível.
Palavras-chave: catecol-O-metiltransferase, Paracoccidioides, expressão heteróloga
