Desenvolvimento de sondas fluorescentes reativas para aplicação em bioconjugação.

Resumo: A “fluorescência” é um fenômeno físico de emissão de fótons por corpos frios após excitação por fontes luminosas, sendo um dos diversos processos luminescentes observados na natureza. Os primeiros relatos acerca desse fenômeno datam do séc XVI, tendo sido melhor compreendido a partir de meados do séc XIX. Pouco depois das primeiras descrições científicas, o potencial analítico do fenômeno da fluorescência passou a ser amplamente proposto e explorado. Uma série de técnicas analíticas baseadas na fluorescência são rotineiramente exploradas nas áreas das ciências da vida, dentre as quais podemos citar ensaios imunofluorimétricos, citometria de fluxo, PCR quantitativo, e as diversas técnicas microscópicas baseadas em fluorescência. Em geral, o uso de técnicas baseadas na emissão de fluorescência está associado com alta sensibilidade e seletividade. Outra vantagem é a multidimensionalidade da fluorescência, sendo que não só a intensidade da emissão pode ser analisada, mas também tempo de vida de fluorescência e a anisotropia da emissão. Por fim, a emissão da fluorescência pode ser modulada pelo ambiente, o que é amplamente explorado no desenvolvimento de sensores fluorescentes.

O avanço na aplicação da fluorescência como parâmetro analítico está intimamente relacionado com o desenvolvimento de sondas fluorescentes (também chamados fluoróforos ou fluorocromos), que são compostos químicos com capacidade intrínseca de emitir fluorescência. Ainda que existam alguns exemplos de técnicas fluorimétricas baseadas na fluorescência intrínseca do analito, na grande maioria dos casos sondas fluorescentes exógenas são utilizadas. Atualmente existem sondas fluorescentes de diversas naturezas químicas, como lantanídeos, quantum dots, proteínas fluorescentes, dentre outras; todavia, a maior parte dos fluoróforos disponíveis são pequenas moléculas orgânicas de origem sintética.

Diversos grupos de corantes fluorescentes orgânicos são conhecidos e amplamente aplicados como sondas fluorescentes exógenas. Em geral, a estrutura desses corantes se baseia em ciclos aromáticos e/ou heteroaromáticos planos, com extenso sistema de duplas ligações conjugadas. Derivados sintéticos da xantona, como a fluoresceína e a rodamina, estão entre as sondas mais populares, com diversos derivados disponíveis comercialmente. Outra classe muito explorada como sondas fluorescentes são as cumarinas. Caracterizadas por um anel benzeno fundido a uma anel pirona o núcleo cumarínico é a estrutura base de muitas sondas de uso biológico18. O naftaleno e o pireno são dois hidrocarbonetos aromáticos policíclicos que encontraram ampla aplicação como sondas fluorescentes. Outros núcleos presentes em corantes fluorescentes incluem a acridina, acridona, fenoxazina, fenantridina, bimane, bisbenzimida, indol, esquaraina, diarilmetano, nitrobezoxidiazol (NBD), oxonol dentre outros.

Neste projeto serão desenvolvidos novos fluoróforos orgânicos baseados no núcleo heterocíclico 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno, mais conhecidos pelo acrônimo “BODIPY”. O esqueleto básico do BODIPY se baseia em duas unidades pirrólicas unidas por uma ponte metino (núcleo dipirrina), complexadas um átomo de boro (geralmente um grupo difluoroboril). Os BODIPYs são derivados pirrólicos similares a porfirinas, porfirazinas e ftalocianinas, sintetizados a partir da reação de unidades pirrólicas com eletrófilos carbonilados, seguido de complexação com reagente de boro. O alto rendimento quântico de fluorescência, associado ao alto coeficiente de absorptividade molar impeliram a aplicação de BODIPYs como fluoróforos, todavia vale citar que uma vantagem fundamental dos BODIPYs é a sua versatilidade química. Atualmente são descritas diversas maneiras de realizar a sua funcionalização, através da modificação química dos materiais de partida ou por métodos de modificação direta do anel BODIPY.

Uma das aplicações mais comuns de fluorórforos na área da bioquímica se trata da conjugação a biomoléculas, e esse conceito será explorado neste projeto. Alguns derivados reativos de BODIPY inéditos foram idealizados pelos pesquisadores envolvidos e serão preparados a partir de síntese química. Nesses compostos, o núcleo fluorescente do BODIPY será funcionalizado com grupos reativos, que serão posteriormente explorados para bioconjugação com biomoléculas. Dentre os grupos reativos propostos neste projeto estão o isotiocianato, haletos orgânicos e o cloreto de sulfonila, que se tratam de funções orgânicas de característica eletrofílica que podem reagir com os nucleófilos presentes nas biomoléculas. Além da funcionalização com grupos reativos, serão realizadas ainda alterações na estrutura química que conferem propriedades fotofísica particulares aos fluoróforos. A inserção de substituintes aromáticos diretamente no núcleo BODIPY será explorada para a preparação de compostos reativos com emissão de fluorescência desviada para o vermelho

A aplicação dos fluoróforos em bioconjugação serão testadas utilizando a albumina bovina sérica (BSA), como uma proteína modelo. A reação de bioconjugação dos fluoróforos será realizada em tampão fosfato e em tampão carbonato com dimetilsulfóxido (DMSO) ou acetonitrila como co-solventes. Uma solução padrão de BSA será tratada com os diversos fluoróforos com concentração final variando entre 1 e 10 eq, a fim de otimizar o processo de bioconjugação. A proteína marcada com fluorescência será purificada e dessalinizada em resina de gel filtração. A ocorrência e a eficiência do processo de bioconjugação será avaliada em ensaios de fluorimetria e por eletroforese em gel de poliacrilaminda.

Data de início: 01/04/2019
Prazo (meses): 24

Participantes:

Papel	Nome
Aluno Mestrado	VANESSA GOBBI AMORIM
Aluno Mestrado	REBECA LIRIO DE OLIVEIRA
Coordenador	LUCAS CUNHA DIAS DE REZENDE